內切酶的酶切出現(xiàn)問題，先看內切酶說明書，相應試劑公司目錄。不同公司出產的內切酶，菌株來源、制備工藝、純度活力、酶切活性優(yōu)化可能不同，酶切效果也有差別。可在上面找到酶單位定義、保存條件、酶切體系、酶切反應溫度、酶是否受甲基化影響等。
1.質粒問題
制備不當?shù)腄NA樣品、純度差或殘留酶切污染（抑制物）。雜蛋白存在會影響酶切，表現(xiàn)為A260/A280低于1.8；抑制物常見酚、乙醇、蛋白質、EDTA、SDS、高鹽等。
A260/A280是在測量DNA、RNA提純后的純度的，如果有蛋白質污染，這個比值就比較小。因為蛋白質在280處有吸收值。高純度的DNA、RNA這個比值應該在1.8-2左右。
2.酶的問題
確認內切酶有效（很多內切酶雖然有過期時間，但過期后只要能夠有效酶切，可用。確認酶切效果不好，做標記，更換）。
3.buffer問題
有些酶切的buffer中，添加了一些較為容易析出或溶解的成分，有時酶切的buffer沒有*融化時，buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分，鹽離子濃度要高，使用一段時間后，融化部分的離子濃度會變低。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對離子濃度敏感的內切酶時就會出現(xiàn)問題。
4.雙酶切的buffer選擇
確認使用的是正確的buffer和反應溫度。
5.酶切位點的甲基化影響
限制性內切酶不能切割甲基化的識別序列。常見的有Xba I、Bcl I等。甲基化主要分為Dam、Dcm和CpG甲基化等。大腸桿菌等原核生物具有限制－修飾系統(tǒng)，Dam、Dcm常使DNA樣品甲基化而不被切割。如果是直接從哺乳動物細胞中提取的DNA，則部分DNA會因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點被甲基化后，酶切會受影響。因此，出現(xiàn)酶切不開或不全時需要考慮甲基化的問題。
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